المحتوى
الكهربائي بولي هلام الأكريلاميد ، أو PAGE ، هي تقنية تستخدم لفصل الجزيئات العضوية في عينة بيولوجية. تنتقل الجزيئات ذات الحجم والوزن الأصغر بسرعة إلى هلام بولي أكريلاميد عند تطبيق تيار كهربائي. عادةً ما يتم ملاحظة شرائط مميزة حادة بعد احتضان الجل المكتمل في مكان ما. هذه طريقة بسيطة نسبيا. ومع ذلك ، فإن عدم وجود نطاقات أو نطاقات غير واضحة أو غير واضحة قد يشير إلى وجود مشكلة في خطوة أو أكثر من خطوات الطريقة. يجب اتباع الإرشادات الأساسية لحل مشاكل طريقة الرحلان الكهربائي الهلامي التي لا تكون النتائج كما هو متوقع.
الاتجاهات
-
نبدأ مع الخطوة الأخيرة من رحلان الكهربائي الهلامي وأعمل بأثر رجعي. بالنسبة لعملية الرحلان الكهربائي للهلام ، فإن الخطوة الأخيرة هي إجراء تلطيخ يستخدم لمراقبة نطاقات العينة. يجب أن تحدث بعض المشاكل في الواقع أثناء عملية تلطيخ. ومع ذلك ، يجب إذابة صبغة البقع جيدًا في المخزن المؤقت المناسب قبل استخدامها لصبغ الجل. تأكد من استخدام تركيز الصبغة الصحيح.
-
تحقق من مصدر الطاقة. قد يشير عدم وجود نطاقات إلى أن التكوين الحالي أو الجهد العالي مرتفع للغاية وأن عينات الاختبار تهاجر خارج الجل. يمكن أن تتسبب الإعدادات العالية أيضًا في انتقال مكونات العينة عبر الجل بسرعة كبيرة ، مما ينتج عنه دقة رديئة ونطاقات غير واضحة. قد لا تنتقل العينات عبر الجل إذا كان تكوين مصدر الطاقة منخفضًا. قد تتراكم العينات أيضًا في البئر حيث تم تحميلها ولا تنتقل عبر الجل.
-
تحقق من مادة الأكريلاميد السائل المستخدمة لتحويل هلام بولي أكريلاميد. عادةً ما تتراوح نسبة مادة الأكريلاميد المستخدمة لتحويل هلام بولي أكريلاميد من 5٪ إلى 15٪. يتم تحميل عينات تتكون من جزيئات أكبر على هلام 5 ٪ لأن شظايا كبيرة تتحرك ببطء أكبر في الجل مع نسبة أعلى من الأكريلاميد. يتم تحميل جزيئات صغيرة على هلام أعلى نسبة لأن تركيز منخفض من هلام لن تكون قادرة على معالجة عينات أصغر.
-
فحص الكواشف المستخدمة في بلمرة الأكريلاميد. يتكون هلام بولي أكريلاميد عن طريق بلمرة خليط سائل يتكون من أكريلاميد مكرر وأكريلاميد. تتم إضافة بيرسلفات الأمونيوم و TEMED إلى مادة الأكريلاميد لتحفيز تكوين الهلام. عادة ، ينبغي أن تظهر مادة الأكريلاميد علامات البلمرة (تشكيل هلام) بعد 15 دقيقة من إضافة كبريتات الأمونيوم و TEMED. البلمرة التي تحدث بسرعة كبيرة هي نتيجة لكميات كبيرة من كبريتات الأمونيوم. عندما تكون غير كافية ، فقد تسبب بلمرة غير كاملة أو غير مستوية.
-
تأكيد كمية العينات المحملة. يمكن تركيزات عالية من العينة تتحرك ببطء من خلال الجل وتقليل دقة الفرقة. لا يمكن ملاحظة تركيز العينة المنخفض بعد تلطيخ الجل. تقدم هذه الأصباغ قيودًا على الحد الأدنى لمقدار العينة التي يمكن تصورها نتيجة لحساسية الألوان.
-
تأكيد جودة العينات المحملة. يمكن أن تؤثر الأملاح والملوثات الأخرى الموجودة في العينة على حركة العينة على امتداد الجل. الكهربائي هو نتيجة لتمرير التيار الكهربائي من خلال هلام يحتوي على عازلة تيار موصل. تركيزات عالية من الأملاح في العينة قد تؤثر على حركة هذا التيار من خلال هلام. عند عزل عينة ، يجب تضمين مجموعة تنقية لإنتاج عينة نقية نسبيًا.
-
راجع الأدبيات أو البروتوكول المكتوب لتحديد ما إذا كان قد تم استخدام "PAGE" الصحيح لإجراء التجربة. نسبة مادة الأكريلاميد في "PAGE" خاصة بحجم العينة المراد اختبارها. يمكن للأدب أيضًا تقديم معلومات محددة فيما يتعلق بإنشاء مصدر الطاقة ومعدل انتقال العينة.
نصائح
- المبادئ التوجيهية المقدمة عامة للتطبيقات في مجال البحوث البيولوجية.
- عند حل أي إجراء مختبري ، من الأفضل البدء بالخطوة الأخيرة والعمل بأثر رجعي من أجل تحديد المشكلة.
تحذير
- عند التعامل مع مادة الأكريلاميد والبولي أكريلاميد ، ارتد قفازات. الأكريلاميد عبارة عن كاشف سام للسمية ويمكن امتصاصه عن طريق الجلد. بولي أكريلاميد ليس سامًا للأعصاب ، ومع ذلك ، فإنه يحتوي غالبًا على الأكريلاميد غير المبلمر ويمكن اعتباره سامًا.
ما تحتاجه
- درجة الجودة مكرر: لوحات الأكريلاميد أو لوحات مسبقة الصنع
- اثنين من لوحات الزجاج
- مكرر الأكريلاميد
- TBE العازلة (تريس ، حمض البوريك ، EDTA)
- امدادات الطاقة
- غطاء الغرفة العلوية
- سقف الغرفة السفلى
- البروتين عينة الحمض النووي
- TEMED
- كبريتات الأمونيوم
- جل للتلوين